无缝克隆加样计算器
同源重组依据：诺唯赞 C117 说明书 V24.1 第 07 页；经验比例依据：NEB NEBuilder HiFi 官方手册；T4 连接依据：NEB M0202 官方方案（详见页尾"计算规则与出处"）
模式 A · 严格按 C117 说明书
单片段 1:2（0.03/0.06 pmol）；多片段 1:1（各 0.03 pmol）；限 10–100 ng；片段长于载体自动互换公式
模式 B · 经验比例（自动）
1–2 个片段自动按 2×，≥3 个自动 1:1；<200 bp 片段自动 5×（NEB 经典规则）
模式 C · 传统酶切连接（T4）
载体:片段 = 1:3 摩尔比（NEB M0202 经典），20 μl 体系，16 ℃ 过夜
反应体系
10 μl（说明书）
20 μl
5 μl
插入片段数
载体基准
固定 50 ng（NEB 推荐 50–100 ng）
固定 100 ng
0.03 pmol
0.05 pmol
反应体系
20 μl（NEB 经典）
10 μl
载体用量
ng
载体:片段
1:1
1:2
1:3（NEB 经典）
1:5
1:10
T4 连接酶
μl
载入示例
清空
角色
片段名称
长度 (bp)
浓度 (ng/μl)
计算加样体积
组分
加样体积 (μl)
用量 (ng)
摩尔量 (pmol)
摩尔比
提示
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计算规则与出处（含官方链接）
模式 A · 严格按 C117 说明书（V24.1 第 07 页「07-1 重组反应」）：
体系 10 μl：2 × CE Mix V3 5 μl + 载体 X μl + 片段 Y₁…Yₙ μl + ddH₂O 补足。
单片段：载体
0.02 × bp
ng（0.03 pmol），片段
0.04 × bp
ng（0.06 pmol），摩尔比 1:2；
片段长于载体时两者公式互换
（仅单片段适用）。
多片段（n ≥ 2）：载体与每个片段各
0.02 × bp
ng（0.03 pmol），摩尔比 1:1。
投入量限 10–100 ng（超范围取边界）；单组分加样 ≥1 μl（不足需稀释）；DNA 总体积 >5 μl 时等比降量；兼容范围 0.003–0.25 pmol。
模式 B · 经验比例（NEB NEBuilder HiFi 官方规则，同源组装最经典默认）：
载体基准默认 50 ng（NEB 推荐 50–100 ng），可切换为 100 ng / 0.03 pmol / 0.05 pmol。
1–2 个插入片段：每片段按载体 2× 摩尔量
（vector:insert = 1:2）；
≥3 个插入片段：全部 1:1 等摩尔
。
<200 bp 的片段自动按 5× 摩尔量
（"Use 5-fold molar excess of any insert(s) less than 200 bp"）。
出处：
NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction Protocol (NEB)
；
NEBuilder HiFi 手册 PDF (E2621/E5520)
。
模式 C · 传统酶切连接（T4 DNA Ligase，NEB M0202 经典方案）：
20 μl 体系：10 × 连接 Buffer 2 μl + 载体 DNA 50 ng + 插入片段（
载体:片段 = 1:3 摩尔比
）+ T4 DNA Ligase 1 μl（最后加）+ ddH₂O 补足。
黏末端：16 ℃ 过夜或室温 10 min；平末端：16 ℃ 过夜或室温 2 h；65 ℃ 10 min 热灭活；取 1–5 μl 转化 50 μl 感受态。
出处：
Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (NEB M0202)
。
摩尔换算：
ng = pmol × bp × 0.66
（dsDNA 660 g/mol/bp；NEB 用 650，差异 <2%，可忽略）。